Preuzmite priručnik

Suština metode. Western blotting (imunoblotting, od engleskog. Upijanje- blotting) je moderna, visoko osjetljiva analitička metoda koja se koristi za određivanje specifičnih proteina u uzorku korištenjem antitijela.

Metoda se zasniva na kombinaciji gel elektroforeze i imunohemijske reakcije “antigen/antitijelo (test protein)”. Visok stepen rezolucije postiže se elektroforetskim odvajanjem proteina i specifičnošću mono- ili poliklonskih antitela. Pod optimalnim uslovima, Western blotting može otkriti protein u količinama manjim od 1 ng.

Western blotting koraci:

1. Odvajanje proteina SDS elektroforezom. Najčešća metoda za odvajanje proteina je elektroforeza na poliakrilamidnom gelu u prisustvu natrijum dodecil sulfata. SDS). U prisustvu SDS-a, proteini koji se analiziraju dobijaju isti negativni naboj, što omogućava njihovo razdvajanje u zavisnosti samo od molekularne težine. Denaturirani proteini migriraju u električnom polju kroz akrilamidni gel do anode, pri čemu se manji proteini kreću brže. Markeri (mješavina proteina poznate molekulske težine) se također nanose na gel. Razlike u brzini napredovanja (elektroforetska pokretljivost) dovode do razdvajanja proteina u trake.
2. Prijenos proteina sa gela na membranu(napravljen od nitroceluloze ili poliviniliden fluorida). PVDF) nastaje pod uticajem električne struje. Kao rezultat ovog procesa, proteini završavaju u tankom površinskom sloju membrane, gdje se vezuju za membranu zbog hidrofobnih i elektrostatičkih interakcija. Proteini se kreću od gela do membrane zadržavajući svoju lokaciju. Tako nakon elektrotransfera dobijamo repliku gela na nitrocelulozi sa proteinima koji se nalaze na isti način kao u poliakrilamidnom gelu.
3. Blokiranje. Kako bi se spriječilo nespecifično vezivanje antitijela za membranu, potonja se inkubira u razrijeđenom proteinskom rastvoru - obično se koristi goveđi serumski albumin ili obrano mlijeko u prahu. Protein iz razrijeđene otopine vezuje se za membranu na mjestima gdje nema proteinskih traka. Kao rezultat toga, antitijela, kada se dodaju, mogu se vezati samo za specifična mjesta vezivanja za proteine ​​koji se proučavaju. Blokiranje vam omogućava da postignete čistu pozadinu i eliminišete lažno pozitivne rezultate.
4. Vezivanje ispitivanog proteina za antitijela. Nakon blokiranja membrane, ona se ispere puferom (3 puta) i uzastopno inkubira s različitim antitijelima metodom „sendvič“: prvo se proteini vezuju za primarna (mono- ili poliklonalna) antitijela, koja se zauzvrat vezuju za sekundarna antitijela. konjugiran sa enzimima (peroksidaza hrena ili alkalna fosfataza).
5. Detekcija. Vizualizacija proteina koji se proučava postiže se izvođenjem odgovarajuće biohemijske reakcije za formiranje proizvoda, koja se određuje kolorimetrijskim, hemiluminiscentnim ili fluorescentnim metodama detekcije. Količina proteina se procjenjuje pomoću denzitometrije.

Planirano vizualizirati i kvantificirati fotosistem 2 koji sakuplja svjetlost kompleksnog proteina Lhcb2 iz tilakoida Arabidopsis thaliana.
Sva pitanja i prijedlozi poslati na adresu.

Western blotting

Profesor na Katedri za biohemiju
i molekularne biologije,
Doktor medicinskih nauka Spirina Ljudmila
Viktorovna
Western blotting

Definicija. Western blotting
(Western blot,

analitički
metoda,
koristi se za
definicije
specifičan
proteina u uzorku.

Definicija. Western blot (Western blot, proteinski imunoblot, Western blot)

Definicija. Western blotting
(Western blot,
proteinski imunoblot, Western blot)
Western blot je razvijen u laboratoriji
George Stark (Stanford, UK)
Naziv Western blot dobio je W. tehniku.
autora Neila Burnetta i igra je riječi iz
imena Southern Blotting. razvijene metode za određivanje DNK
bivši Edwin Southern

Western blotting je razvijen u laboratoriji Georgea Starka (Stanford, UK)

Western blotting
metoda određivanja
proteini
Southern blotting tehnike
DNK određivanja,
razvijeno
ranije Edwin
Southern
upijanje).
Slična metoda
Određivanje RNK
pod nazivom Northern
Upijanje (nothern
upijanje).
Detekcija
post-translacijski
modifikacije proteina
pod nazivom istočni
Upijanje (istočno
upijanje).

protokol. PROTOKOL

PROTOKOL
1. Odvajanje proteina
SDS-PAGE gel elektroforezom/
Korištenje gel elektroforeze
proteini se razdvajaju na
poliakrilamidni gel.
2. Transfer proteina u
membrana
3. Blokiranje i detekcija
Zatim se detektuju sa
koristeći antitela:
proteini se prvo vezuju za
primarni (mono ili
poliklonska) antitijela,
što zauzvrat
kontakt
sa sekundarnim antitelima,
konjugiran sa enzimima
(peroksidaza hrena ili
alkalna fosfataza).

protokol. Western blotting može otkriti antigen u količinama manjim od 1 ng.

protokol.
Western blotting može otkriti
antigen u količinama manjim od 1 ng.
4. Vizualizacija.
Visok stepen
rezolucija se postiže u
elektroforetski račun
odvajanje proteina i
specifičnost
monoklonska antitela.
Vizualizacija
protein od interesa
postignuto od strane
izvođenje
prikladno
biohemijska reakcija sa
formiranje proizvoda,
koja je određena
kolorimetrijski, hemiluminiscentni,
fluorescentne metode
detekcija.

5. Analiza.

Količina proteina se procjenjuje iz
pomoću denzitometrije.

Southern Blotting Ova metoda identifikuje jedinstvene fragmente DNK koji su otprilike milioniti dio veličine genoma.

Genomska DNK (obično
izvučeno iz
leukociti ili ćelije
voće) se deli na
kratki fragmenti,
razdvojite ih u agarozu
gel, prebačen na
membrana, dakle
identifikovati
specifičnim područjima sa
korištenjem hibridizacije sa
oligonukleotid
sonde.

Northern Blotting

Slično kao Southern Blotting.
Ova metoda nam omogućava da identifikujemo specifične
mRNA i procijeniti njenu veličinu.

Eastern blotting (nastavak Western blotting metode)

Definicija Western Blotting metode

Metoda se zasniva na
kombinacije gel elektroforeze i
imunohemijski
reakcije antigen-antitijelo.

"Solidna faza" za imunoblotiranje

vrsta poroznih materijala
nitroceluloza (PVDF) u obliku
punila u zapremini ili obliku
ravnim listovima ili trakama
(engleska traka); trake se koriste u
tehnike kao što su imunobloting i
imunohromatografija;
u poroznim materijalima je neophodno
veća površina na kojoj
jedan od učesnika je sorbiran
interakcije; drugi reagensi
difundiraju kroz pore.

Vrste čvrste faze za Western blotting

Priprema uzorka

Uzorak se može uzeti iz cjeline
tkiva ili iz ćelijske kulture. B Puna tkanina
Ćelijska kultura
u većini slučajeva tvrda tkiva
prvo mehanički zgnječeno
pomoću blendera (za
uzorci velikog volumena), sa
Mehaničko brušenje
pomoću homogenizatora
(manje količine), ili
ultrazvučni tretman.
Razni deterdženti, deterdženti, mlevenje homogenizatorom
soli i puferi mogu biti
prijavljen za
poboljšanje stanične lize i
rastvaranje proteina.
Ultrazvučni tretman
Često su inhibitori proteaze i fosfataze
o se dodaju radi sprječavanja
razdvajanje svojih uzoraka
Mljevenje u tečnom dušiku
sopstvenih enzima.
Često pripremate maramice
izvedeno na niskom
temperature do
Inhibitori proteaze i fosfataze
izbjegavati denaturaciju proteina.
Uslovi koji se poboljšavaju
priprema uzorka
Deterdženti, soli, puferi
homogenizira uzorke protresanjem
u mikroepruvetama ili čašama zajedno sa tvrdim kuglicama
Niske temperature

Gel elektroforeza. Najčešća metoda za odvajanje proteina je elektroforeza na poliakrilamidnom gelu u prisustvu SDS prema Lammyju

Gel elektroforeza. Većina
uobičajena metoda
odvajanje proteina -
elektroforeza u
poliakrilamidni gel u
prisustvo SDS-a prema Lammyju

Gel elektroforeza

Gel elektroforeza
SDS poziva
denaturacija proteina
i podržava ih u tome
denaturisan
stanje, za
uništenje
sekundarno i
tercijarne strukture
koriste se proteini
redukcioni agensi
disulfid
veze

Gel elektroforeza

Predmet
analiza proteina
prisustvo
dodecil sulfat
dobitak natrijuma
isto
negativan
naplaćuje šta radi
moguće ih
podjela na
samo zavisnosti
od molekularnog

Princip elektroforeze

Ranije
denaturisani proteini
stavite u džepove "traka"
(trake) akrilamid gel
sa niskom koncentracijom
(koncentrirajući gel) to
omogućava vam da ih koncentrišete
prije preseljenja u
odvajajući gel (sa više
visoka koncentracija), gdje
dolazi do odvajanja proteina
zavisno od molekularne
mase.
Proteini migriraju u
električno polje kroz
akrilamidni gel do anode,
dok su proteini manji
veličina se kreće brže.

Princip elektroforeze

Razlike u brzini
promocije -
elektroforetski
mobilnost dovodi do
razdvajanje proteina u trake.
Po pravilu, jedan od
"putevi" su ostavljeni za
markeri molekularne mase
(mješavine proteina sa poznatim
mase).

Gelovi za bojenje

bojenje proteina
gelovi sa bojom
Coomassie
bojenje proteina
srebrni gelovi
Za češće vizualizaciju rezultata elektroforeze
Uglavnom se koristi bojenje proteina u gelovima
Coomassie boja ili srebro

U većini slučajeva rezultati
elektroforetsko odvajanje je dovoljno
dobijeno vizuelnom procenom gela.
Međutim, kako bi se dobili pouzdani podaci i
odgovarajuću dokumentaciju rezultata gela
skenirano putem prijenosa pomoću visoko osjetljivog
denzitometar, koji vam omogućava pouzdano određivanje
samo položaj proteina u gelu, već i optički
gustina proteinske mrlje.
Bojanje
membrane više
pouzdano

Analiza elektroforetskog odvajanja proteina, Blotting

Korištenje posebne softverske aplikacije
možete definirati parametre kao što su
elektroforetsku pokretljivost proteina, njegovu
čistoća, količina proteina u mrlji, itd.
Najčešće se koristi hemiluminiscentni sistem
detekcija proteina - upotreba rendgenskih filmova
(upijanje)
Koristi
softver
Aplikacija ImageJ

Primjena sistema vizualizacije za WB (vidi dolje)

Elektroforetska analiza razdvajanja proteina

Određivanje molekulske težine proteina koji se proučava
ukazuje na potrebu kalibracije gela prema
molekulske težine. Kalibrirajte gel u odnosu na
molekularne težine proteinskih markera koji
odvojeno paralelno sa ispitnim uzorkom.

Odabir % gela za razrjeđivanje.

koncentracija
akrilamid određuje
dozvoljavajući
sposobnost gela - nego
veća koncentracija
akrilamid, to bolje
razdvajanje
niske molekularne težine
proteini. Nisko
koncentracija
akrilamid poboljšava
dozvoljavajući
sposobnost gel elektroforeze za
visoke molekularne težine
Veličina proteina, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Prijenos na membranu Kako bi proteini bili dostupni antitijelima i dalje otkrivanje, oni se, zajedno sa trakom gela, prenose na membranu, ekstrudiraju

Prenesite na membranu
Da bi proteini bili dostupni za antitijela i dalje otkrivanje, oni se kombiniraju sa trakom
Gel se prenosi na membranu napravljenu od nitroceluloze ili PVDF-a.
Membrana se postavlja preko gela,
a na njega se postavlja stog
filter papir.
Metoda prijenosa proteina
naziva se elektroblotiranje i
koristi električnu struju, koja
prenosi proteine ​​iz gela na membranu.
Proteini prelaze iz gela u
membrane uz održavanje svoje
lokacija. Kao rezultat ovoga
"blotting" proces
proteini se drže tankim
površinski sloj membrane za
detekcija.
Obje varijante membrane se koriste zbog svojih nespecifičnih svojstava vezivanja.
proteini.
Vezivanje za proteine ​​se zasniva na oba
na hidrofobne interakcije, dakle
i na elektrostatičkom
interakcije između membrane i
proteina.
Nitrocelulozna membrana je jeftinija
PVDF, ali mnogo krhkiji i lošiji
podnosi višekratnu primjenu
marks.

Vrste elektroblotinga

Suha
Mokro
Polusuvo
(polusuh)

Bojenje proteina na filteru

Way
bojanje
Ponceau S
osjetljivost,
količina
vjeverica
1-2µg
Nitroceluloza
+
Najlon
-
PVDF
+
Amido
Crna
1,5µg
+
-
+
Comassie
plava
1,5µg
+
-
+
Indijsko mastilo
100ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Koloidno
zlato
3ng
+
-
+
Bojanje
reverzibilan
konstantna, niska pozadina
konstantna, visoka pozadina
trajno
trajno, blijedi sa
vrijeme
trajno

Potvrda prijenosa proteina u filter (Ponceus mrlja)

Blokiranje

Jednom odabrano
membrana, odabrana antitijela
a ciljni protein bi trebao
biće preduzete mere da se
izbegavajte interakciju
između membrane i
antitelo koje se koristi za
otkrivanje ciljnog proteina (jer
antitelo je samo po sebi protein).
Blokiranje
nespecifična vezivanja
postiže prostorija
membrane u razblaženom stanju
proteinski rastvor - obično ovo
goveđa surutka
albumin ili mršav
mleko u prahu ili želatin
sa malim procentom
deterdžent tipa Tween-20.
Blokiranje je jedno od
važne faze
izvođenje
efektivni zapadni
upijanje

Mehanizam za zaključavanje

Protein
od razrijeđenog
rješenje je priloženo
membrana na svim mestima,
gdje meta nije pričvršćena
proteina. Stoga, kada
dodavanjem antitela
(antitijela) nema slobodnog
mesta na membrani, gde god
mogli su da prikače
osim za mjesta vezivanja na
specifična meta
vjeverice Ova pozadina
"buka" u finalu
Western blot proizvod
vodi do čistog
rezultate i
isključujući lažno

Detekcija. Indirektni i direktni WB

prednosti
Sekundarna antitijela pojačavaju signal (nekoliko sekundarnih
antitela se mogu vezati za jednu primarnu)
Dostupna široka paleta sekundarnih antitijela
Jedno sekundarno antitelo se može koristiti za
otkrivanje različitih specifičnih antitijela
vezivanje za enzimsku oznaku sekundarnog antitijela nije
utiče na imunoreaktivnost primarnog antitela
Zamjena sekundarnog antitijela može doprinijeti promjeni
metoda detekcije
mane
Sekundarna antitijela potiču formiranje mjesta
nespecifično vezivanje
Dodatni radni koraci
prednosti
potrebno koristiti samo
primarna antitijela, što ubrzava proces
mogućnost korištenja primarnog
antitijela sa različitim oznakama
Nedostaci
vezivanje za enzimsku oznaku
može smanjiti imunoreaktivnost
primarno antitelo
visoka cijena primarnih antitijela
problem selekcije antitela i nizak
signal

Detection. Sljedeći korak je reakcija vezivanja proteina koji se proučava sa specifičnim antitijelom (primarnim).

Rastvor antitijela i membrana
mogu se zatvoriti zajedno i
inkubirano 30 minuta
prije odlaska preko noći.
Oni takođe mogu biti
inkubirano na
različite temperature,
sa povećanim
posmatrana temperatura
bolje vezivanje.
Nakon uklanjanja
nevezani primarni
antitela, membrana
izdržati sa sekundarnim
antitijela iu skladu
sa svojim ciljnim svojstvima,
obično zove

Antitijela za Western bloting. Mehanizam detekcije.

Antitela se dobijaju iz
životinjski izvor i
kontakt
većina primarnih
antitela. Sekundarni
antitela se obično vezuju
alkalna fosfataza ili
peroksidaza hrena.
Većina
uobičajeno,
povezane s peroksidazom
sekundarna antitijela na hren
koristi se za
rezanje
hemiluminiscentna
agens i produkt reakcije
proizvodi luminiscentno
zračenje je proporcionalno
količina proteina.
List fotoosjetljiv
fotografski film
postavljen nasuprot membrani
i izložen je
reakcija zračenja, stvaranje
slika traka antitijela na
mrlja.
Jeftinije ali manje
osjetljiv pristup sa
korištenjem bojenja 4-kloronaftolom
pomešan sa 1% peroksida
vodonik, koji daje tamno smeđu boju,
koji je registrovan bez
upotreba specijalnih
fotografski film.

Druga metoda detekcije
sekundarna antitela
koristi antitela sa
vezani fluorofor,
koji emituje unutra
blizu infracrvene
područje (NIR). svjetlo,
emituje
fluorescentna
boja, trajna i
čini fluorescentnim
detekcija preciznija i
na osetljiv način
mjerenje razlike u
proizveden signal
proteini koji su označeni
antitela, Western
mrlja.

Detection. Druge metode detekcije.

Treća alternativa
metoda koristi
radioaktivni tragač
umesto enzima
povezan sa sekundarnim
antitelo (sa
radioaktivni izotop
jod). Druge metode
sigurnije, brže i
jeftinije, dakle
radioaktivna detekcija
retko se koristi.

Vizualizacija.

Vizualizacija
sprovedeno sa
uz pomoć gel dokumentacije
sistemi ili digitalni
kamera.

Prezentacija filma

Tehnologija bez mrlja

U praksi, ne u svim
Vesterni su otkriveni
proteini u samo jednom pojasu
na membrani.
Približna veličina
izračunajte poređenjem
trake u boji sa
molekularni markeri
mise dodane u
elektroforeza.
Proces će se ponoviti sa
strukturni proteini,
kao što je aktin ili
tubulina, koji nisu
mijenjati između
eksperimenti. Količina
ciljni protein zavisi od
kontrolna količina
strukturni protein između
u grupama. Ova tehnika
obezbeđuje korekciju
količina ukupnih proteina po
membrane u slučaju greške

Analiza i prezentacija rezultata.

Upotreba
softver
Slike aplikacija
J.
Softver
Aplikacija BioRad

IHC
Imun
fluorescencija
Western
upijanje

Primjena metode

Western blotting
korišteno
u molekularnom
biologija, biohemija, gen
tika i drugi
prirodne nauke
discipline.
u medicini:
HIV dijagnoza
(AIDS), bolest
limete, Helicobacter
Pylori, Epstein Barr virus

Potpuni protokol

1. elektroforeza
2. transfer
3. blokiranje
4. inkubacija sa
primarno antitelo
5.pranje
6.inkubacija sa
sekundarno antitelo
7. pranje
8. obrada
hemiluminiscentna
sistem za detekciju
9. detekcija korištenjem
rendgenski film
10. analiza

Primjena u praktičnoj medicini

Potvrda
HIV infekcija
Dijagnoza krpelja
borelioza (lajmska bolest)
Dijagnoza antraksa
Dijagnoza toksoplazmoze
(T);
grupa infekcija -
hepatitis, sifilis,
klamidija, listerioza itd.
(O);
rubeola (R);
citomegalovirus
infekcija (C);
herpes (H).
Epstein-Barr virus
U ovom slučaju, membrane test traka su obložene
samo
klinički
značajan
antigeni
(domaći,
sintetički ili rekombinantni) u određenom
ok. Ovaj pristup se koristi za diferencijal
dijagnosticiranje više infekcija na jednoj traci

Kada se DNK, RNK ili proteini razdvoje, moraju se prenijeti na čvrsti nosač za detekciju i druge operacije koje je teško izvesti u gelu. Proces prijenosa koji vodi do imobilizacija molekula , tj. fiksiran u stacionarnom stanju naziva se upijanje (na engleskom - upijanje ). Kao podloga koriste se najlonske ili nitrocelulozne membrane.

Upijanje(od engleskog blotting - blotting) je metoda prijenosa elektroforetskih fragmenata DNK na poseban film (membranu) napravljen od nitroceluloze koji veže (imobilizira) jednolančane DNK molekule.

Southern blotting(po imenu autora koji ga je predložio) zasniva se na kretanju fragmenata DNK zbog kapilarnog efekta. Proces prenošenja fragmenata DNK u agaroznom gelu na nitrocelulozni film pomoću filter papira sličan je upijanju.

Analiza se provodi na sljedeći način:

– Izolovana, pročišćena, denaturirana i fragmentirana DNK stavlja se na list agaroznog gela, gdje se fragmenti elektroforetski razdvajaju po masi i naboju.

– List agaroznog gela stavlja se na filter papir navlažen koncentrovanim fiziološkim (puferskim) rastvorom.

– Zatim se na gel nanosi nitrocelulozni filter, gdje dolazi do imobilizacije (ili adsorpcije, ili fiksacije) jednolančanih fragmenata DNK.

– Na vrh filtera se stavlja hrpa listova suvog filter papira, čime se obezbeđuje spor protok puferske otopine kroz gel (odnosno služi kao neka vrsta kapilarne pumpe). Slani rastvor, prolazeći kroz agarozni gel, nosi sa sobom fragmente DNK, koji se zadržavaju i vezuju nitrocelulozom, a rastvor se apsorbuje suvim filter papirom.

– Zatim se DNK denaturira alkalijom, a filter se drži u vakuumu na temperaturi od 80 0 C, zbog čega se jednolančani DNK fragmenti nepovratno imobiliziraju (fiksiraju) na nitrocelulozu. U ovom slučaju, lokacija imobiliziranih DNK traka tačno odgovara njihovoj lokaciji u gelu.

– DNK vezana za filter stavlja se u rastvor sa DNK obeleženom sondom, u kojoj dolazi do hibridizacije. Samo njemu komplementarni DNK fragmenti će se hibridizirati (formirati vodonične veze) sa specifičnom sondom, koja se može detektirati kao svjetlosne pruge na rendgenskom filmu, tj. autoradiografija nitroceluloznog filtera

Dot blot. Za pripremu dot blotova, DNK ili RNK preparat se nanosi direktno na filter. Kapljice lijeka izgledaju kao tačke na filteru, što objašnjava naziv vrste upijanja (engleski dot). 1) Od genomske DNK prethodno tretirane ultrazvukom, formiraju se fragmenti dužine 5-10 parova nukleotida.

2) Da bi DNK ili RNK sonde bile dostupne sondi, potrebno ih je denaturirati, tj. pretvoriti u jednolančani oblik. To se dešava pod uticajem temperature od 100 °C.

3) Denaturirane nukleinske kiseline se inkubiraju na ledu: brz pad temperature sprečava njihovu renaturaciju, tj. komplementarno uparivanje lanaca. Denaturirana DNK ili RNK se nanosi direktno na filter, koji se inkubira u otopini koja sadrži sondu.

4) Da bi se spriječilo da analizirana nukleinska kiselina ode u otopinu, mora se fiksirati na filter (membranu). Za to se koriste dvije vrste filtera: nitrocelulozni i najlonski.

Za imobilizaciju nukleinskih kiselina na nitroceluloznom filteru koristi se prženje na 80 °C u vakuumu, a na najlonskom filteru se koristi UV zračenje 3-5 minuta.

5) Nakon inkubacije preparata nukleinske kiseline sa izotopom obeleženom sondom, radi se autoradiografija u posebnoj kaseti ili identifikacija neradioaktivnim metodama.

Dot blotting vam omogućava da odgovorite na samo jedno pitanje: da li je željena nukleotidna sekvenca prisutna u datom uzorku.

Northern blot analiza primjenjuje se:

1) izolovati i analizirati RNK (na primjer, utvrditi da li je mRNA očitana iz datog gena prisutna u datom tipu ćelije, tj. da li je gen eksprimiran ili ne;

2) utvrditi količinu ove RNK i njene promene u razvoju date vrste ćelije;

3) da se odredi veličina transkripta gena.

U ovom slučaju, molekule RNK izolovane iz ćelije se razdvajaju po veličini pomoću gel elektroforeze, a zatim se prenose u filter. Nakon hibridizacije sa obeleženom jednolančanom sondom, identifikuju se mesta hibridizacije (homologija) RNK i sonde.

Ako nukleotidni slijed željenog gena (ili mRNA) nije poznat, ali je poznat protein čiju sintezu kontrolira, tada je moguće izolovati malu količinu čistog proteina i odrediti aminokiselinsku sekvencu nekog od njih (znanje dovoljno je 5-6 aminokiselinskih ostataka). Koristeći tabelu genetskih kodova, moguće je uspostaviti sve moguće sekvence nukleotida u dijelu mRNA (ili samog gena) koji kodira datu sekvencu aminokiselina. U ovom slučaju, sonda se može sintetizirati za traženje željenih klonova u biblioteci gena.

Western blottinG(imunoelectroblotting, protein blotting) je metoda za identifikaciju jedinstvenih proteina. Zasniva se na fenomenu visoko specifične interakcije antigen-antitijelo. Dakle, antigen (cilja) je protein koji se određuje, a sonda je antitijelo na njega.

Antitijela na proučavani protein dobivaju se na različite načine. Najjednostavnije je ubrizgati pročišćeni uzorak proteina u krvotok laboratorijske životinje (obično zeca). Njegovo tijelo proizvodi antitijela (imunoglobuline) na ovaj strani protein. To su primarna antitijela koja će stupiti u interakciju sa ciljnim proteinom.

Međutim, ne bi bilo racionalno uvoditi identifikacionu oznaku direktno u podatke o antitijelima. Detekcija različitih proteina bi zahtijevala označavanje različitih antitijela, što bi rezultiralo visokim troškovima. Ispostavilo se da je razumnije koristiti univerzalna antitela – konjugovanih antiimunoglobulina, koji su u suštini antitijela na antitijela proizvedena korištenjem identificiranog proteina kao antigena. Na primjer, konjugirani anti-imunoglobulini za zečji Ig će interagirati sa svim imunoglobulinima sintetiziranim kod kunića u različite antigene. Dakle, upravo takva univerzalna sekundarna antitijela nose izotopsku ili neradioaktivnu oznaku. Pored neizotopske oznake, koja u toku niza reakcija dovodi do stvaranja netopivog obojenog jedinjenja (kao u slučaju blotinga nukleinske kiseline), hemiluminiscentna oznaka, koja ima veću osjetljivost, vrlo je često korišteni.

1) Ekstrakcija proteina iz homogenata

2) Odvajanje proteina prema molekularnoj težini pomoću SDS-poliakrilamid gel elektroforeze (PAGE). Metoda SDS elektroforeze uključuje denaturaciju nativnih proteina. Dakle, molekuli proteina sa istom molekulskom težinom će putovati istom putanjom u gelu i poredati se u obliku pruge. Budući da su proteinski molekuli različitih veličina prisutni u smjesi, formiraju se mnoge trake. Rezultati elektroforeze se mogu vizualizirati bojenjem proteina (Coomassie brilliant blue, amido black, srebrno bojenje). Bojenje srebrom ima jedinstvenu osjetljivost koja omogućava detekciju samo 0,1 ng proteina u rezultirajućem pojasu. Ovo je vrlo važno za kontrolu količine proteina nanesenog na gel.

3) Transfer proteina sa gela na membranu. To je učinjeno jer poliakrilamid ne dozvoljava difuziju velikih molekula imunoglobulina u protein. A protein imobiliziran na membrani postaje dostupan antitijelima. Za razliku od blotinga nukleinskom kiselinom, prijenos proteina na membranu se odvija pod utjecajem električnih sila, tj. u električnom polju.

4) Dobijeni blot se inkubira sa antiserumom za protein, a zatim sa antiimunoglobulinima. Rezultat se vizualizira u skladu s vrstom etikete koja se koristi.

Ograničenja:

1) velika veličina fragmenata koji se proučavaju, koja značajno premašuje dužinu DNK sondi i sprečava direktnu molekularnu analizu;

2) nemogućnost proizvoljnog odabira krajeva proučavanih sekvenci, što je određeno prisustvom odgovarajućih restrikcijskih mesta u originalnom molekulu DNK;

3) potreba za velikom količinom dobro pročišćene genomske DNK visoke molekularne težine (najmanje 10 μg po reakciji, što je ekvivalentno 0,5-1 ml krvi),

4) za genomsku hibridizaciju - prisustvo radioaktivnih DNK sondi sa visokom specifičnom aktivnošću od najmanje 109 impulsa/min*µg), koje rade u ograničenom vremenskom periodu, i posebno opremljene izotopske jedinice. Osim toga, produženo izlaganje autograma značajno produžava vrijeme za postizanje rezultata.

5) visok intenzitet rada istraživanja

Generale.

Sve zapadnjačke metode inscenacije sastoje se od sljedećih koraka:

1) transfer proteina sa gela na membranu;
2) blokiranje nespecifične sorpcije;
3) adsorpcija I-antitela;
4) pranje;
5) adsorpcija II-antitela;
6) pranje;
7) razvoj filtera;

Koju vrstu membrane koristiti: NC ili PVDV (kažu da je ova druga osjetljivija) ovisi samo o vašem ukusu. NC membrana je krhkija, ali uz pažljiv rad to se ne primjećuje.

Tačku po tačku.

Da li ćete šišati gel, ostavljajući samo ono područje koje želite da vidite na slici prije transfera, nakon transfera ili ga uopće ne šišati, ovisi o vašoj želji da sačuvate membranu i antitijela.

Može se raditi u gel kupki.

Ali bolje je nanijeti sve odjednom bez mjehurića.

Ili ~3mA po pojedinačnoj traci.

Ponekad je korisno označiti položaj granica gela, bunara itd.

Možete kontrolirati koliko proteina ostaje u gelu nakon prijenosa bojenjem gela.

Hibridizacija.

Filter treba uvijek biti mokar.

Osušena PVDF membrana mora se navlažiti metanolom.

Strana P (na koju je izvršen transfer) treba da bude u kontaktu sa rastvorom.

Hibridizacija sa a/t vrši se u hibridizatoru na 26 o C u malim cilindrima ili CF epruvetama od 50 ml. Volumen otopine za hibridizaciju je ~3ml (što je minimalno moguće, ali tako da se membrana ne osuši).

Pranje i punjenje: sa NT, mućkanje u kadi (poklopac od tipova) V=30-50ml.

Ili bacite otopinu ili izvršite hibridizaciju u njoj, samo nemojte ispuštati koncentrirani a/t na filter.

Za punjenje nespecifičnih materijala najbolje je koristiti mlijeko u prahu (moguće je i BSA, ali nama se manje sviđa). Različite serije se neznatno razlikuju u intenzitetu pozadine.

Sipajte rastvor za hibridizaciju u CF epruvetu od 50 ml, dodajte potrebnu količinu a/t, promešajte. Postavite filter uz zid epruvete i stavite ga u hibridizator.

Ako ne znate u kojem razrjeđenju djeluje a/ts, onda ćete to morati eksperimentalno utvrditi.

Vrijeme interakcije s antitijelima može se povećati ili smanjiti ovisno o vašim antitijelima.

Hibridizacija se provodi u 0,1-0,15 M NaCl, smanjenje jonske snage uzrokuje snažnu nespecifičnu hibridizaciju.

Veoma važno!!! Rastvor sa antitelima se može koristiti više puta (5-7). Dovoljno ga je zamrznuti nakon upotrebe na -20 o C. Ova procedura radi barem za hibridizacijski pufer: 1x PBS (bez Mg++/Ca++), 0,3-1,0% Suvo mlijeko, Antitijela.

Prilikom imunološkog bojenja nakon imunoprecipitacije, pozadina se može ukloniti prekonjugacijom sekundarnih antitijela na primarna.

Navedena procedura nije jedina. Opcije:

1. Uradite sve sa NT na platformi za ljuljanje, hibridizaciju i pakovanje u plastične kese (V rastvor ~1,5ml, zavisno od veličine filtera), pranje u kadi:
1. fil: 3% mlijeko u prahu, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1h 0,3% mlijeko u prahu, 1x PBS, antiserum;
3. pranje 3 puta x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" u 1x PBS;
5. pranje kao u koraku 3.

Uprkos značajno manjem sadržaju suvog mleka u hibridizacionom puferu za “I” a/t i njegovom potpunom odsustvu u puferu za “II” a/t, ova metoda je dala jasne slike. Očigledno je uspjeh bio određen kvalitetom korištenih vozila.

2. Pranje i punjenje se obavljaju u kadi. Hibridizacija: stavite komad parafilma (veći od membrane) na sto i na njega 0,5-1 ml rastvora za hibridizaciju sa a/t. Postavite membranu stranom (P) okrenutom prema rastvoru, izbegavajući mehuriće, a gornji deo prekrijte komadom parafilma veličine membrane. Inkubirajte 1h.

Ova metoda smanjuje volumen mješavine za hibridizaciju, ali može pogoršati kvalitetu hibridizacije.

Maksimalni sjaj se javlja 4-5" nakon nanošenja rastvora (razuman intenzitet sjaja se održava 15-20").

Opis

Metoda određivanja Imunoblot (Western blot)

Materijal koji se proučava Krvni serum

Mogućnost kućne posjete

Opsežna studija IgM antitijela na Borrelia antigene pomoću Western blota. Izvor antigena u ovom testu su proteini iz ekstrakta posebno odabranog soja Borrelia afzelii i rekombinantnog VisE antigena.

VisE	Izražena glavna varijabilna sekvenca nalik proteinu	Specifičan
83 kDa	Protein membranskih vezikula p83	Specifičan
39 kDa	BmpA, str. 39	Specifičan
31 kDa	OspA, str. 31	Specifičan
30 kDa	str 30	Specifičan
25 kDa	OspC, str. 25, marker nedavne infekcije	Specifičan
21 kDa	str 21	Specifičan
19 kDa	str 19	Specifičan
17 kDa	str 17	Specifičan

Prevalencija pozitivnih anti-borelia IgM antitijela putem Western blota kod klinički okarakteriziranih pacijenata s boreliozom i zdravih davalaca krvi:

Književnost

1. Dolgikh T.I. Savremene mogućnosti laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti (metode, algoritmi, interpretacija rezultata). Omsk: 2005. - 40 str.
2. Informativno-metodološko pismo „Prevencija i dijagnostika borelioze koju prenose krpelji“ broj 17-22/65 od 17.05.2005. Moskva.”
3. Klinička važnost različitih odgovora IgG i IgM antitijela na Borrelia bugdorferi nakon antibiotske terapije za erythema migrans. Dugotrajna studija praćenja 113 pacijenata. - Arch.dermatol. 2006, vol. 142, str. 862-868.
4. Nau R., Christen H-J., Eiffert H. Lyme Disease— Current State of Knowledge. - Dtsch Arztebl Int. 2009; 106(5): 72-82
5. Materijali proizvođača reagensa (Euroimmun).

Priprema

Format rezultata: kvalitativni (opis prisutnosti/odsustva traka koje karakteriziraju detekciju antitijela na svaki od navedenih antigena u obliku „pozitivnog” ili „negativnog”; opći zaključak o rezultatu studije u obliku: „pozitivan ”/“negativno”/”neizvjesno”) .

Referentne vrijednosti: negativne.

Interpretacija rezultata

Pozitivno. Otkrivena su antitijela IgM klase. Detekcija IgM antitijela protiv različitih Borrelia specifičnih antigena, u odsustvu antitijela na OspC, ne smatra se dovoljnim pokazateljem nedavne infekcije. Da bi se postavila dijagnoza infekcije svježom boreliozom, pozitivan rezultat IgM antitijela treba potvrditi 3-6 sedmica kasnije pozitivnim rezultatom IgG antitijela na svježem uzorku krvi.

Negativno. Nisu otkrivena IgM antitijela. Negativan IgM nalaz ne isključuje u potpunosti mogućnost nedavne infekcije. Ukoliko postoji klinička sumnja na boreliozu koju prenosite krpeljima, preporučljivo je ponoviti test na specifična IgM i IgG antitijela nakon 3-4 sedmice.

Nesiguran. Na osnovu rezultata studije (slaba traka OspC antigena, odsustvo drugih pozitivnih traka za specifične antigene), nemoguće je dati definitivan zaključak o prisustvu IgM antitela na boreliju. Ako postoji klinička sumnja na boreliozu koju prenose krpelji, preporučljivo je ponoviti ispitivanje nakon 3-4 sedmice.