Stáhněte si manuál

Podstata metody. Western blotting (imunoblotting, z angl. Blotování- blotting) je moderní, vysoce citlivá analytická metoda používaná ke stanovení specifických proteinů ve vzorku pomocí protilátek.

Metoda je založena na kombinaci gelové elektroforézy a imunochemické reakce „antigen/protilátka (testovaný protein)“. Vysokého stupně rozlišení je dosaženo elektroforetickou separací proteinů a specifitou mono- nebo polyklonálních protilátek. Za optimálních podmínek může Western blot detekovat protein v množství menším než 1 ng.

Kroky Western blotting:

1. Separace proteinů SDS elektroforézou. Nejběžnější metodou pro separaci proteinů je elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného. SDS). V přítomnosti SDS získávají analyzované proteiny stejný negativní náboj, což umožňuje jejich separaci pouze v závislosti na molekulové hmotnosti. Denaturované proteiny migrují v elektrickém poli přes akrylamidový gel k anodě, přičemž menší proteiny se pohybují rychleji. Na gel se také aplikují markery (směs proteinů se známou molekulovou hmotností). Rozdíly v rychlosti postupu (elektroforetické pohyblivosti) vedou k separaci proteinů do pásů.
2. Přenos proteinů z gelu na membránu(vyrobené z nitrocelulózy nebo polyvinylidenfluoridu). PVDF) vzniká pod vlivem elektrického proudu. Výsledkem tohoto procesu je, že proteiny končí v tenké povrchové vrstvě membrány, kde se na membránu vážou v důsledku hydrofobních a elektrostatických interakcí. Proteiny se přesouvají z gelu do membrány, přičemž si zachovávají svou polohu. Po elektropřenosu tak získáme repliku gelu na nitrocelulóze s proteiny umístěnými stejně jako v polyakrylamidovém gelu.
3. Blokování. Aby se zabránilo nespecifické vazbě protilátek na membránu, membrána se inkubuje ve zředěném proteinovém roztoku - obvykle se používá hovězí sérový albumin nebo sušené odstředěné mléko. Protein ze zředěného roztoku se váže na membránu v místech, kde nejsou žádné proteinové pásy. V důsledku toho se protilátky, pokud jsou přidány, mohou vázat pouze na specifická vazebná místa pro studované proteiny. Blokování umožňuje dosáhnout čistého pozadí a eliminovat falešně pozitivní výsledky.
4. Vazba studovaného proteinu na protilátky. Po zablokování membrány je promyta pufrem (3x) a postupně inkubována s různými protilátkami pomocí „sendvičové“ metody: nejprve se proteiny navážou na primární (mono- nebo polyklonální) protilátky, které se zase vážou na sekundární protilátky. konjugované s enzymy (peroxidáza křen nebo alkalická fosfatáza).
5. Detekce. Vizualizace studovaného proteinu je dosažena provedením vhodné biochemické reakce za vzniku produktu, který je stanoven kolorimetrickými, chemiluminiscenčními nebo fluorescenčními detekčními metodami. Množství proteinu se stanoví pomocí denzitometrie.

Plánováno vizualizujte a kvantifikujte fotosystém 2, komplex protein Lhcb2 sbírající světlo z thylakoidů Arabidopsis thaliana.
Všechny dotazy a návrhy poslat na adresu.

Western blotting

Profesor katedry biochemie
a molekulární biologie,
Doktor lékařských věd Spirina Ludmila
Victorovna
Western blotting

Definice. Western blotting
(Western blot,

analytická
metoda,
používá
definice
charakteristický
proteiny ve vzorku.

Definice. Western blot (Western blot, proteinový imunoblot, Western blot)

Definice. Western blotting
(Western blot,
proteinový imunoblot, Western blot)
Western blot byl vyvinut v laboratoři
George Stark (Stanford, Velká Británie)
W. technice byl dán název Western blot.
od Neila Burnetta a je slovní hříčkou
jména Southern Blot. vyvinuty metody pro stanovení DNA
dříve Edwin Southern

Western blotting byl vyvinut v laboratoři George Starka (Stanford, Velká Británie)

Western blotting
metoda stanovení
proteiny
Southern blotting techniky
stanovení DNA,
rozvinutý
dříve Edwin
Jižní
blotování).
Podobná metoda
Stanovení RNA
s názvem Severní
Blotování (Nothern
blotování).
Detekce
post-translační
proteinové modifikace
zvané východní
Blotování (východní
blotování).

protokol. PROTOKOL

PROTOKOL
1. Separace bílkovin
gelovou elektroforézou SDS-PAGE/
Použití gelové elektroforézy
proteiny se dělí na
polyakrylamidový gel.
2. Přenos bílkovin do
membrána
3. Blokování a detekce
Poté jsou detekovány pomocí
pomocí protilátek:
proteiny se nejprve vážou
primární (mono- nebo
polyklonální) protilátky,
což zase
Kontakt
se sekundárními protilátkami,
konjugované s enzymy
(křenová peroxidáza popř
alkalická fosfatáza).

protokol. Western blot může detekovat antigen v množství menším než 1 ng.

protokol.
Western blotting dokáže detekovat
antigen v množství menším než 1 ng.
4. Vizualizace.
Vysoký stupeň
rozlišení je dosaženo v
elektroforetický účet
separace bílkovin a
specifičnost
monoklonální protilátky.
Vizualizace
protein zájmu
dosažené tím
provádění
odpovídající
biochemická reakce s
tvorba produktu,
která je určena
kolorimetrické, chemiluminiscenční,
fluorescenční metody
detekce.

5. Analýza.

Množství bílkovin se odhaduje z
pomocí denzitometrie.

Southern blotting Tato metoda identifikuje jedinečné fragmenty DNA, které jsou přibližně jedné miliontiny velikosti genomu.

Genomová DNA (obvykle
extrahováno z
leukocyty nebo buňky
ovoce) se dělí na
krátké fragmenty,
oddělte je v agaróze
gel, přenesený do
membrána tedy
identifikovat
konkrétní oblasti s
pomocí hybridizace s
oligonukleotid
sondy.

Northern blotting

Podobné jako Southern blotting.
Tato metoda nám umožňuje identifikovat konkrétní
mRNA a odhadnout její velikost.

Eastern blotting (pokračování metody Western blotting)

Definice metody Western blotting

Metoda je založena na
kombinace gelové elektroforézy a
imunochemické
reakce antigen-protilátka.

"Pevná fáze" pro imunoblotování

typ porézních materiálů
nitrocelulóza (PVDF) ve formě
plniva v objemu nebo formě
ploché plechy nebo pásy
(anglický pás); pásy se používají v
techniky, jako je imunoblotování a
imunochromatografie;
v porézních materiálech je to nezbytné
větší plocha, na které
jeden z účastníků je pohlcen
interakce; jiná činidla
difundovat přes póry.

Typy pevné fáze pro Western blotting

příprava vzorků

Vzorek lze odebrat z celku
tkáně nebo z buněčné kultury. B Plná látka
Buněčná kultura
ve většině případů tvrdé tkáně
nejprve mechanicky rozdrceno
pomocí mixéru (např
velkoobjemové vzorky), s
Mechanické broušení
pomocí homogenizátoru
(menší objemy), popř
ošetření ultrazvukem.
Různé detergenty detergenty, Mletí homogenizátorem
soli a pufry mohou být
požádáno
zlepšení buněčné lýzy a
rozpouštění bílkovin.
Ošetření ultrazvukem
Inhibitory proteázy a fosfatázy jsou často
o jsou přidány, aby se zabránilo
rozdělování jejich vzorků
Mletí v kapalném dusíku
vlastní enzymy.
Častá příprava tkání
prováděno na nízké úrovni
teploty do
Inhibitory proteázy a fosfatázy
vyhnout se denaturaci bílkovin.
Podmínky, které se zlepšují
příprava vzorků
Detergenty, soli, pufry
homogenizuje vzorky jejich třepáním
v mikrozkumavkách nebo kelímcích spolu s tvrdými kuličkami
Nízké teploty

Gelová elektroforéza. Nejběžnější metodou separace proteinů je elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS podle Lammyho

Gelová elektroforéza. Většina
běžná metoda
separace bílkovin -
elektroforéza v
v polyakrylamidovém gelu
přítomnost BL podle Lammyho

Gelová elektroforéza

Gelová elektroforéza
SDS volání
denaturace bílkovin
a podporuje je v tom
denaturované
stav, pro
zničení
sekundární a
terciární struktury
používají se proteiny
redukční činidla
disulfid
spojení

Gelová elektroforéza

Předmět
proteinová analýza
přítomnost
dodecylsulfát
zisk sodíku
stejný
negativní
účtovat, co dělá
je možné
rozdělení na
pouze závislosti
z molekulárního

Princip elektroforézy

Dříve
denaturované proteiny
dát do kapes „stop“
(stopy) akrylamidový gel
s nízkou koncentrací
(koncentrační gel), že
umožňuje vám je soustředit
před přestěhováním do
separační gel (s více
vysoká koncentrace), kde
dochází k separaci bílkovin
v závislosti na molekul
masy.
Proteiny migrují do
skrz elektrické pole
akrylamidový gel na anodu,
zatímco bílkoviny jsou menší
velikost se pohybuje rychleji.

Princip elektroforézy

Rozdíly v rychlosti
propagace -
elektroforetický
mobilita vede k
separace proteinů do pásů.
Zpravidla jeden z
„cesty“ jsou ponechány
markery molekulové hmotnosti
(směsi proteinů se známými
masy).

Barvicí gely

barvení bílkovin
gely s barvivem
Coomassie
barvení bílkovin
stříbrné gely
Častěji vizualizovat výsledky elektroforézy
Obecně se používá barvení proteinů v gelech
Coomassie barvivo nebo stříbro

Ve většině případů výsledky
postačuje elektroforetická separace
získané vizuálním hodnocením gelu.
Aby však bylo možné získat spolehlivá data a
řádná dokumentace výsledků gelu
skenované prostřednictvím přenosu pomocí vysoce citlivého
hustoměr, který umožňuje spolehlivě určit
pouze poloha proteinů v gelu, ale i optická
hustota proteinové skvrny.
Zbarvení
membrány více
spolehlivě

Analýza elektroforetické separace proteinů, blotování

Pomocí speciální softwarové aplikace
můžete definovat parametry jako např
elektroforetická pohyblivost proteinu, jeho
čistota, množství bílkovin ve skvrně atd.
Nejčastěji se používá chemiluminiscenční systém
detekce proteinů - využití rentgenových filmů
(Blotting)
Použití
software
aplikace ImageJ

Aplikace vizualizačního systému pro WB (viz níže)

Elektroforetická proteinová separační analýza

Stanovení molekulové hmotnosti studovaného proteinu
naznačuje nutnost kalibrace gelu podle
molekulové hmotnosti. Kalibrujte gel vzhledem k
molekulové hmotnosti proteinových markerů, které
oddělené paralelně se zkušebním vzorkem.

Výběr % rozpouštěcího gelu.

koncentrace
akrylamid určuje
dovolující
gelová schopnost - než
vyšší koncentrace
akrylamid, tím lépe
oddělení
nízkou molekulovou hmotností
proteiny. Nízký
koncentrace
akrylamid zlepšuje
dovolující
schopnost gelové elektroforézy pro
vysokou molekulovou hmotností
Velikost proteinu, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Přenos na membránu Pro zpřístupnění proteinů pro protilátky a další detekci jsou spolu s proužkem gelu přeneseny na membránu, vytlačeny

Přeneste na membránu
Aby byly proteiny dostupné pro protilátky a další detekci, jsou kombinovány s proužkem
Gel se přenese na membránu vyrobenou z nitrocelulózy nebo PVDF.
Membrána je umístěna přes gel,
a na něj se umístí stoh
filtrační papír.
Metoda přenosu bílkovin
tzv. elektroblotování a
využívá elektrický proud, který
přenáší proteiny z gelu na membránu.
Proteiny se přesunou z gelu do
membrána při zachování její
umístění. Jako výsledek
proces „blotting“.
proteiny jsou drženy tenké
povrchová vrstva membrány pro
detekce.
Obě membránové varianty se používají kvůli jejich nespecifickým vazebným vlastnostem.
proteiny.
Vazba na bílkoviny je založena na obou
na hydrofobních interakcích, tak
a na elektrostatickém
interakce mezi membránou a
protein.
Nitrocelulózová membrána je levnější
PVDF, ale mnohem křehčí a horší
odolává opakované aplikaci
značky.

Typy elektroblotování

Schnout
Mokrý
Polosuché
(polosuchý)

Barvení bílkovin na filtru

Cesta
zbarvení
Ponceau S
Citlivost,
Množství
veverka
1-2 ug
Nitrocelulóza
+
Nylon
-
PVDF
+
Amido
Černá
1,5 ug
+
-
+
Comassie
modrý
1,5 ug
+
-
+
Indický inkoust
100 ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Koloidní
zlato
3ng
+
-
+
Zbarvení
reverzibilní
konstantní, nízké pozadí
konstantní, vysoké pozadí
trvalý
trvalé, bledne s
čas
trvalý

Potvrzení přenosu bílkovin na filtr (ponceusovo barvení)

Blokování

Po výběru
membrána, vybrané protilátky
a cílový protein by měl
budou přijata opatření
vyhnout se interakci
mezi membránou a
protilátka použitá pro
detekce cílového proteinu (protože
protilátka je sama o sobě protein).
Blokování
nespecifické vazby
dosažené místností
membrány ve zřed
proteinový roztok - obvykle toto
hovězí syrovátka
albumin nebo libové
sušené mléko nebo želatinu
s malým procentem
detergent typu Tween-20.
Blokování je jedním z
důležité etapy
provádění
efektivní western
blotování

Uzamykací mechanismus

Protein
ze zředěného
řešení je připojeno k
membrána na všech místech,
kde cíl není připojen
protein. Proto, když
přidání protilátek
(protilátky) není volné
místa na membráně, kdekoli
mohli připojit
kromě vazebných míst na
konkrétní cíl
veverky Toto pozadí
"hluk" ve finále
Produkt Western blot
vede k čištění
výsledky a
s výjimkou nepravdivých

Detekce. Nepřímé a přímé WB

výhody
Sekundární protilátka zesiluje signál (několik sekundárních
protilátky se mohou vázat na jednu primární)
K dispozici je široká škála sekundárních protilátek
Může být použita jedna sekundární protilátka
detekce různých specifických protilátek
vazba na enzymatickou značku sekundární protilátky není
ovlivňuje imunoreaktivitu primární protilátky
Nahrazení sekundární protilátky může přispět ke změně
detekční metoda
nedostatky
Sekundární protilátky podporují tvorbu místa
nespecifická vazba
Další pracovní kroky
výhody
potřeba pouze používat
primární protilátky, což proces urychluje
schopnost používat primární
protilátky s různými značkami
Nedostatky
vazba na enzymatickou značku
může snížit imunoreaktivitu
primární protilátka
vysoká cena primárních protilátek
problém výběru protilátek a nízké
signál

Detekce. Dalším krokem je vazebná reakce studovaného proteinu se specifickou protilátkou (primární).

Roztok protilátky a membrána
lze uzavřít dohromady a
inkubována po dobu 30 minut
před odjezdem přes noc.
Mohou také být
inkubováno při
různé teploty,
se zvýšeným
pozorovaná teplota
lepší vazba.
Po odstranění
nevázaný primární
protilátky, membrána
vydržet se sekundárním
protilátky a v souladu
s jejich cílovými vlastnostmi,
obvykle volán

Protilátky pro Western blotting. Detekční mechanismus.

Protilátky se získávají z
živočišný zdroj a
Kontakt
většina primárních
protilátky. Sekundární
protilátky se obvykle vážou
alkalická fosfatáza popř
křenová peroxidáza.
Většina
běžný,
související s peroxidázou
křenové sekundární protilátky
používá
řezání
chemiluminiscenční
činidlo a reakční produkt
vytváří luminiscenční
záření je úměrné
množství bílkovin.
List fotocitlivý
fotografický film
umístěna naproti membráně
a je vystaven
reakce záření, tvoření
obrázek pruhů protilátek na
skvrna.
Levnější, ale méně
citlivý přístup s
za použití 4-chloronaftolového barvení
smíchaný s 1% peroxidem
vodík, který dává tmavě hnědou barvu,
který je registrován bez
použití speciálních
fotografický film.

Další metoda detekce
sekundární protilátky
používá protilátky s
vázaný fluorofor,
který vyzařuje v
blízko infračerveného
oblast (NIR). Světlo,
emitované
fluorescenční
barvivo, trvalé a
dělá fluorescenční
detekce přesnější a
citlivým způsobem
měření rozdílu v
vytvořený signál
proteiny, které jsou značené
protilátky, záp
skvrna.

Detekce. Jiné metody detekce.

Třetí alternativa
metoda používá
radioaktivní stopovač
místo enzymu
spojené se sekundárním
protilátka (s
radioaktivní izotop
jód). Jiné metody
bezpečnější, rychlejší a
proto levnější
radioaktivní detekce
málo používané.

Vizualizace.

Vizualizace
prováděno s
s pomocí gelové dokumentace
systémy nebo digitální
Fotoaparát.

Prezentace filmu

Technologie bez skvrn

V praxi ne ve všech
Jsou objeveny westerny
proteiny pouze v jednom pásmu
na membráně.
Přibližná velikost
vypočítat porovnáním
barevné pásy s
molekulární markery
mše přidány v
elektroforéza.
Proces se bude opakovat s
strukturální proteiny,
jako je aktin nebo
tubulin, které nejsou
změna mezi
experimenty. Množství
cílový protein závisí na
kontrolní množství
strukturální protein mezi
ve skupinách. Tato technika
poskytuje nápravu
množství celkových bílkovin na
membrána v případě chyby

Analýza a prezentace výsledků.

Používání
software
Obrazové aplikace
J.
Software
Aplikace BioRad

IHC
Imunní
fluorescence
Západní
blotování

Aplikace metody

Western blotting
použitý
v molekulární
biologie, biochemie, gen
tika a další
přírodní vědy
disciplínách.
V medicíně:
Diagnóza HIV
(AIDS), nemoc
limetka, Helicobacter
Pylori, virus Epsteina Barra

Kompletní protokol

1. elektroforéza
2. převod
3. blokování
4. inkubace s
primární protilátka
5.praní
6.inkubace s
sekundární protilátka
7. praní
8. zpracování
chemiluminiscenční
detekční systém
9. detekce pomocí
rentgenový film
10. rozbor

Aplikace v praktické medicíně

potvrzení
HIV infekce
Diagnostika klíšťaty
borelióza (lymská borelióza)
Diagnóza antraxu
Diagnóza toxoplazmózy
(T);
skupina infekcí -
hepatitida, syfilis,
chlamydie, listerióza atd.
(O);
zarděnky (R);
cytomegaloviru
infekce (C);
herpes (H).
virus Epstein-Barrové
V tomto případě jsou membrány testovacích proužků potaženy
pouze
klinicky
významný
antigeny
(rodák,
syntetický nebo rekombinantní) v určitém
OK. Tento přístup se používá pro diferenciál
diagnostikování více infekcí na jednom proužku

Jakmile jsou DNA, RNA nebo proteiny odděleny, musí být přeneseny na pevný nosič pro detekci a další operace, které se v gelu obtížně provádějí. Proces převodu vedoucí k imobilizace molekul , tj. se nazývá pevný ve stacionárním stavu blotování (v angličtině. - blotování ). Jako substrát se používají nylonové nebo nitrocelulózové membrány.

Blotování(z anglického blotting - blotting) je metoda přenosu elektroforetických fragmentů DNA na speciální film (membránu) vyrobený z nitrocelulózy, která váže (imobilizuje) jednovláknové molekuly DNA.

Southern blotting(podle jména autora, který to navrhl) je založen na pohybu fragmentů DNA v důsledku kapilárního efektu. Proces přenosu fragmentů DNA obsažených v agarózovém gelu na nitrocelulózový film pomocí filtračního papíru je podobný blotování.

Analýza se provádí následovně:

– Izolovaná, purifikovaná, denaturovaná a fragmentovaná DNA je umístěna na plát agarózového gelu, kde jsou fragmenty elektroforeticky odděleny podle hmotnosti a náboje.

– List agarózového gelu se umístí na filtrační papír navlhčený koncentrovaným fyziologickým roztokem (pufrem).

– Poté je na gel aplikován nitrocelulózový filtr, kde dochází k imobilizaci (resp. adsorpci, resp. fixaci) jednovláknových fragmentů DNA.

– Na filtr je umístěn stoh listů suchého filtračního papíru, který zajišťuje pomalý průtok tlumivého roztoku gelem (tj. slouží jako druh kapilárního čerpadla). Fyziologický roztok, procházející agarózovým gelem, s sebou nese fragmenty DNA, které jsou zadrženy a vázány nitrocelulózou, a roztok je absorbován suchým filtračním papírem.

– Dále je DNA denaturována alkálií a filtr je udržován ve vakuu při teplotě 80 0 C, v důsledku čehož jsou jednovláknové fragmenty DNA nevratně imobilizovány (fixovány) na nitrocelulóze. V tomto případě umístění imobilizovaných proužků DNA přesně odpovídá jejich umístění v gelu.

– DNA navázaná na filtr se umístí do roztoku se sondou značenou DNA, ve které dochází k hybridizaci. Pouze fragmenty DNA k ní komplementární budou hybridizovat (vytvářet vodíkové vazby) se specifickou sondou, kterou lze detekovat jako světlé pruhy na rentgenovém filmu, tzn. autorádiografie nitrocelulózového filtru

Dot blot. Pro přípravu dot blotů se přípravek DNA nebo RNA aplikuje přímo na filtr. Kapky drogy vypadají jako tečky na filtru, což vysvětluje název typu blottingu (anglicky: dot). 1) Z genomové DNA předem ošetřené ultrazvukem se vytvoří fragmenty dlouhé 5–10 nukleotidových párů.

2) Aby byly sondy DNA nebo RNA přístupné sondě, je potřeba je denaturovat, tzn. převést na jednořetězcovou formu. K tomu dochází vlivem teploty 100 °C.

3) Denaturované nukleové kyseliny se inkubují na ledu: rychlý pokles teploty zabrání jejich renaturaci, tzn. komplementární párování řetězců. Denaturovaná DNA nebo RNA se aplikuje přímo na filtr, který se inkubuje v roztoku obsahujícím sondu.

4) Aby se analyzovaná nukleová kyselina nedostala do roztoku, musí být fixována na filtru (membráně). K tomu se používají dva typy filtrů: nitrocelulózový a nylonový.

K imobilizaci nukleových kyselin na nitrocelulózovém filtru se používá smažení při 80 °C ve vakuu a na nylonovém filtru UV ozařování po dobu 3–5 minut.

5) Po inkubaci preparátu nukleové kyseliny izotopově značenou sondou se provádí autoradiografie ve speciální kazetě nebo identifikace pomocí neradioaktivních metod.

Dot blotting umožňuje odpovědět pouze na jednu otázku: zda je v daném vzorku přítomna požadovaná nukleotidová sekvence.

Analýza Northern blot platí:

1) k izolaci a analýze RNA (například k určení, zda je mRNA přečtená z daného genu přítomna v daném buněčném typu, tj. zda je gen exprimován nebo ne;

2) určit množství této RNA a její změny ve vývoji daného typu buňky;

3) určit velikost transkriptu genu.

V tomto případě jsou molekuly RNA izolované z buňky separovány podle velikosti pomocí gelové elektroforézy a poté přeneseny na filtr. Po hybridizaci se značenou jednovláknovou sondou se identifikují místa hybridizace (homologie) RNA a sondy.

Pokud není známa nukleotidová sekvence požadovaného genu (nebo mRNA), ale je znám protein, jehož syntézu řídí, pak je možné izolovat malé množství čistého proteinu a určit aminokyselinovou sekvenci některé z nich (pozn. stačí 5–6 aminokyselinových zbytků). Pomocí tabulky genetického kódu je možné stanovit všechny možné nukleotidové sekvence v úseku mRNA (nebo genu samotného), který kóduje danou aminokyselinovou sekvenci. V tomto případě může být syntetizována sonda pro hledání požadovaných klonů v genové knihovně.

Western blottinG(imunoelektroblotting, protein blotting) je metoda pro identifikaci unikátních proteinů. Je založen na fenoménu vysoce specifické interakce antigen-protilátka. Antigen (cíl) je tedy stanovovaný protein a sonda je protilátka proti němu.

Protilátky proti studovanému proteinu se získávají různými způsoby. Nejjednodušší je vstříknout vzorek purifikovaného proteinu do krevního oběhu laboratorního zvířete (obvykle králíka). Jeho tělo produkuje protilátky (imunoglobuliny) proti tomuto cizímu proteinu. Jedná se o primární protilátky, které budou interagovat s cílovým proteinem.

Nebylo by však praktické zavádět identifikační značku přímo do údajů o protilátce. Detekce různých proteinů by vyžadovala značení různých protilátek, což by vedlo k vysokým nákladům. Ukázalo se, že je rozumnější používat univerzální protilátky – konjugované antiimunoglobuliny, což jsou v podstatě protilátky proti protilátkám produkovaným použitím identifikovaného proteinu jako antigenu. Například anti-imunoglobuliny konjugované s králičím Ig budou interagovat se všemi imunoglobuliny syntetizovanými u králíků na různé antigeny. Jsou to tedy právě takové univerzální sekundární protilátky, které nesou izotopovou nebo neradioaktivní značku. Kromě neizotopové značky, která v průběhu řady reakcí vede ke vzniku nerozpustné barevné sloučeniny (jako v případě blottingu nukleové kyseliny), je velmi vhodná chemiluminiscenční značka, která má vyšší citlivost. často používaný.

1) Extrakce proteinů z homogenátu

2) Separace proteinů podle molekulové hmotnosti pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE). Metoda SDS elektroforézy zahrnuje denaturaci nativních proteinů. Molekuly proteinu se stejnou molekulovou hmotností tedy projdou stejnou dráhou v gelu a seřadí se ve formě proužku. Protože jsou ve směsi přítomny proteinové molekuly různých velikostí, tvoří se mnoho pásů. Výsledky elektroforézy lze vizualizovat proteinovým barvením (Coomassie brilantní modř, amidočerň, stříbrné barvení). Barvení stříbrem má jedinečnou citlivost, která umožňuje detekci pouhých 0,1 ng proteinu ve výsledném pásu. To je velmi důležité pro kontrolu množství proteinu aplikovaného na gel.

3) Přenos proteinů z gelu na membránu. Děje se tak proto, že polyakrylamid neumožňuje velkým molekulám imunoglobulinu difundovat do proteinu. A protein imobilizovaný na membráně se stává přístupným pro protilátky. Na rozdíl od blottingu nukleové kyseliny dochází k přenosu proteinu na membránu vlivem elektrických sil, tzn. v elektrickém poli.

4) Výsledný blot se inkubuje s antisérem k proteinu a poté s antiimunoglobuliny. Výsledek je vizualizován podle použitého typu štítku.

Omezení:

1) velká velikost studovaných fragmentů, výrazně přesahující délku DNA sond a bránící přímé molekulární analýze;

2) nemožnost libovolného výběru konců studovaných sekvencí, daná přítomností odpovídajících restrikčních míst v původní molekule DNA;

3) potřeba velkého množství dobře vyčištěné vysokomolekulární genomové DNA (alespoň 10 μg na reakci, což odpovídá 0,5–1 ml krve),

4) pro genomovou hybridizaci - přítomnost radioaktivních sond DNA s vysokou specifickou aktivitou alespoň 109 pulzů/min * µg), pracujících po omezenou dobu, a speciálně vybavenou izotopovou jednotkou. Delší vystavení autogramů navíc výrazně prodlužuje dobu získání výsledků.

5) vysoká pracovní náročnost výzkum

Jsou běžné.

Všechny západní inscenační metody se skládají z následujících kroků:

1) přenos proteinu z gelu na membránu;
2) blokování nespecifické sorpce;
3) adsorpce I-protilátek;
4) mytí;
5) adsorpce II-protilátek;
6) mytí;
7) vývoj filtrů;

Jaký typ membrány použít: NC nebo PVDV (říkají, že ta druhá je citlivější), záleží pouze na vašem vkusu. NC membrána je křehčí, ale při pečlivém provozu to není poznat.

Body.

Zda gel oříznout a ponechat pouze oblast, kterou chcete na obrázku vidět před transferem, po transferu, nebo neořezávat vůbec, záleží na vaší touze šetřit membránu a protilátky.

Lze provádět v gelové lázni.

Ale je lepší aplikovat vše najednou bez bublin.

Nebo ~3 mA na jednotlivý pásek.

Někdy je užitečné označit polohu hranic gelu, jamek atd.

Obarvením gelu můžete kontrolovat, kolik bílkovin v gelu po přenosu zůstane.

Hybridizace.

Filtr by měl být vždy mokrý.

Vysušená PVDF membrána musí být navlhčena metanolem.

Strana P (na kterou došlo k přenosu) by měla být v kontaktu s roztokem.

Hybridizace s a/t se provádí v hybridizátoru při 26 o C v malých válcích nebo 50 ml CF zkumavkách. Objem hybridizačního roztoku je ~3ml (co nejmenší, ale tak, aby membrána nevyschla).

Mytí a plnění: s NT, třepání v lázni (víko z typů) V = 30-50ml.

Roztok buď vyhoďte nebo v něm proveďte hybridizaci, jen nekapejte koncentrovanou a/t na filtr.

Pro plnění nespecifických materiálů je nejlepší použít sušené mléko (BSA je také možné, ale nám to chutná méně). Různé šarže se mírně liší intenzitou pozadí.

Nalijte hybridizační roztok do 50ml CF zkumavky, přidejte požadované množství a/t, promíchejte. Položte filtr podél stěny zkumavky a umístěte jej do hybridizéru.

Pokud nevíte, při jakém ředění a/ts funguje, budete to muset určit experimentálně.

Doba interakce s protilátkami může být zvýšena nebo snížena v závislosti na vašich protilátkách.

Hybridizace se provádí v 0,1-0,15M NaCl; pokles iontové síly způsobuje silnou nespecifickou hybridizaci.

Velmi důležité!!! Roztok s protilátkami lze použít vícekrát (5-7). Po použití stačí zamrazit na -20 o C. Tento postup funguje minimálně pro hybridizační pufr: 1x PBS (bez Mg++/Ca++), 0,3-1,0 % Sušené mléko, Protilátky.

Při imunobarvení po imunoprecipitaci lze pozadí odstranit prekonjugací sekundárních protilátek s primárními.

Uvedený postup není jediný. Možnosti:

1. Vše provádějte s NT na kyvné plošině, hybridizace a balení do plastových sáčků (V roztok ~1,5ml, v závislosti na velikosti filtru), mytí v lázni:
1. náplň: 3% sušené mléko, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1 h 0,3% sušené mléko, 1x PBS, antisérum;
3. promytí 3x x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" v 1x PBS;
5. mytí jako v kroku 3.

I přes výrazně nižší obsah sušeného mléka v hybridizačním pufru pro „I“ a/t a jeho úplnou absenci v pufru pro „II“ a/t poskytla tato metoda jasné obrázky. O úspěchu zřejmě rozhodovala kvalita použitých vozidel.

2. Mytí a plnění se provádí v lázni. Hybridizace: na stůl položte kousek parafilmu (větší než membrána) a na něj 0,5-1 ml hybridizačního roztoku s a/t. Umístěte membránu tak, aby strana (P) směřovala k roztoku, aby nevznikaly bubliny, a horní část zakryjte kouskem parafilmu o velikosti membrány. Inkubovat 1h.

Tato metoda snižuje objem hybridizační směsi, ale může zhoršit kvalitu hybridizace.

Maximální záře nastává 4-5" po aplikaci roztoku (přiměřená intenzita záře je udržována po dobu 15-20").

Popis

Metoda stanovení Imunoblot (Western blot)

Studovaný materiál Krevní sérum

Možnost návštěvy domova

Rozsáhlá studie IgM protilátek proti boreliovým antigenům pomocí Western blotu. Diagnostika časných stadií lymské boreliózy je založena především na charakteristických klinických příznacích (erythema migrans). Ale u 20-45% pacientů je možná neerytematózní forma onemocnění. Diagnostika v takových situacích na základě klinických příznaků je téměř nemožná. Ke správné diagnóze často napomáhají sérologické výzkumné metody, i když informační obsah sérologického vyšetření na boreliózu je bohužel omezený. Stanovení protilátek třídy IgM metodou ELISA při sérologické diagnostice boreliové infekce často dává nejasné výsledky. U některých pacientů dochází k dlouhodobé perzistenci protilátek IgM, které tak nemusí vždy odrážet nedávnou infekci. V pozdních stádiích boreliózy pozitivní IgM test neposkytuje žádné další informace. Prevalence protilátek proti boreliím v normální populaci závisí na regionu a u lidí pracujících v lesních oblastech může být až 40 %. IgM protilátky mohou být někdy detekovány roky po vzniku infekce nebo po léčbě antibiotiky. Důvod falešně pozitivních výsledků zůstává často nejasný. Negativní výsledek IgM zároveň nevylučuje přítomnost čerstvé infekce u některých pacientů se současnou infekcí je zaznamenána séronegativita (negativní výsledek při studiu specifických IgM a/nebo IgG). Časté jsou případy nesrovnalostí ve výsledcích testování protilátek proti Borrelia burgdorferi testovacími systémy různých výrobců, což závisí na specifičnosti použitých antigenů a citlivosti systémů. V diagnostice boreliózy je tak často potřeba další sérologické studie, která může poskytnout podrobnější informace v případě nejasného klinického obrazu nebo pochybných výsledků studií IgM a IgG metodou ELISA. Studium IgM protilátek proti boreliím metodou Western blot umožňuje podrobně odpovědět na přítomnost protilátek proti 10 různým boreliovým antigenům, včetně specifického antigenu OspC p25, který je markerem čerstvé infekce. Detekce IgM protilátek proti různým boreliovým specifickým antigenům při absenci protilátek proti OspC není považována za dostatečnou indikaci nedávné infekce. Pro stanovení diagnózy čerstvé boreliové infekce by měl být pozitivní výsledek IgM protilátek potvrzen o 3-6 týdnů později pozitivním výsledkem IgG protilátek z čerstvého vzorku krve. Zdrojem antigenů v tomto testu jsou proteiny z extraktu speciálně vybraného kmene Borrelia afzelii a rekombinantního antigenu VisE. Specificita antigenu:

Svěrák	Exprimovaná hlavní variabilní sekvence podobná proteinu	Charakteristický
83 kDa	Membránový vezikulární protein p83	Charakteristický
39 kDa	BmpA, str. 39	Charakteristický
31 kDa	OspA, str. 31	Charakteristický
30 kDa	str. 30	Charakteristický
25 kDa	OspC, p 25, marker nedávné infekce	Charakteristický
21 kDa	str. 21	Charakteristický
19 kDa	str. 19	Charakteristický
17 kDa	p 17	Charakteristický

Prevalence pozitivních anti-borrelických IgM protilátek metodou Western blot u klinicky charakterizovaných pacientů s boreliózou a zdravých dárců krve:

Literatura

1. Dolgikh T.I. Moderní možnosti laboratorní diagnostiky infekčních onemocnění (metody, algoritmy, interpretace výsledků). Omsk: 2005. - 40 s.
2. Informační a metodický dopis „Prevence a diagnostika klíšťové boreliózy“ č. j. 17-22/65 17. května 2005 Územní odbor Federální služby pro dohled v oblasti ochrany práv spotřebitelů a blaha lidí pro hl. Moskva."
3. Klinický význam různých IgG a IgM protilátkových odpovědí na Borrelia bugdorferi po antibiotické léčbě erythema migrans. Studie dlouhodobého sledování 113 pacientů. - Arch.dermatol. 2006, sv. 142, str. 862-868.
4. Nau R., Christen H-J., Eiffert H. Lyme Disease—Current State of Knowledge. - Dtsch Arztebl Int. 2009; 106(5): 72-82
5. Materiály od výrobce činidel (Euroimmun).

Příprava

Formát výsledku: kvalitativní (popis přítomnosti/nepřítomnosti proužků charakterizujících detekci protilátek proti každému ze specifikovaných antigenů ve formě „pozitivní“ nebo „negativní“; obecný závěr o výsledku studie ve tvaru: „pozitivní“ “/“negativní”/”nejistý”) .

Referenční hodnoty: negativní.

Interpretace výsledků

Pozitivní. Byly detekovány protilátky třídy IgM. Detekce IgM protilátek proti různým boreliovým specifickým antigenům při absenci protilátek proti OspC není považována za dostatečnou indikaci nedávné infekce. Pro stanovení diagnózy čerstvé boreliové infekce by měl být pozitivní výsledek IgM protilátek potvrzen o 3-6 týdnů později pozitivním výsledkem IgG protilátek z čerstvého vzorku krve.

Negativní. Nebyly detekovány žádné IgM protilátky. Negativní výsledek IgM zcela nevylučuje možnost nedávné infekce. Při klinickém podezření na klíšťovou boreliózu je vhodné test na specifické IgM a IgG protilátky po 3-4 týdnech zopakovat.

Nejistý. Na základě výsledků studie (slabý proužek OspC antigenu, nepřítomnost dalších pozitivních proužků pro specifické antigeny) nelze učinit jednoznačný závěr o přítomnosti IgM protilátek proti boreliím. Při klinickém podezření na klíšťovou boreliózu je vhodné studii po 3–4 týdnech zopakovat.